رمزگشایی توالی DNA برای همه شاخه های علوم زیستی، حیاتی است. توالی یابی نسل جدید (NGS)، رویکردی متفاوت در توالی یابی است که تحولی عظیم در علم زیست شناسی ایجاد کرده و جنبه های مختلفی از مطالعات در سطح ژنوم، ترنسکریپتوم، اپی ژنوم و متاژنوم را پوشش می دهد. در مقایسه با روش های سنتی، نسل جدید توالی یابی، با فراهم کردن پوشش بالای ژنومی، تفکیک پذیری در حد تک تک جفت بازها و رفع معایب نسل اول توالی یابی (توالی یابی سانگر)، روشی با کارآیی بالا برای آنالیز اطلاعات ژنومی و ترنسکریپتومی است. استفاده از نسل جدید توالی یابی برای بررسی ترنسکریپتوم موجودات زنده مدل و غیرمدل از سال های 2005 و 2006 پس از تجاری شدن دستگاه های شرکت های مختلف مثل ABI/SOLiD Illumina، Roch/454 Life Science و Solexa آغاز شده است. در سال های اخیر تکنیک توالی یابی RNA برای شناسایی ژن های مرتبط با فرآیندهای رشدونموی و بررسی الگوهای بیان آنها در پاسخ به انواع تنش های زیستی و غیرزیستی، در اندام ها و مراحل متعدد رشدی در موجودات مختلف و همچنین میزان بیان ژن ها، تفکیک ایزوفرم های مختلف از یکدیگر، شناسایی امتزاج ژن ها، یافتن چندشکلی های تک نوکلئوتیدی (SNP)، عناصر تکراری، وقایع اتصال جایگزین، پیداکردن اسیدهای ریبونوکلئیک غیررمزگر، پیداکردن اگزون های ژنی و رونوشت های جدید، مناطق غیرترجمه شونده (UTR)، جهش های پیکری و غیره، به طور گسترده استفاده می شود. روش توالی یابی RNA شامل شناسایی نمونه های زیستی مناسب، استخراج RNAکل، غنی سازی RNAهای غیرریبوزومی، تبدیل RNA به cDNA و ساخت کتابخانه های توالی یابی، انتخاب قطعات براساس اندازه، اضافه کردن لینکرها، استفاده از توالی یاب ها یا پلت فرم های با توان عملیاتی بالا به منظور تولید صدها میلیون خوانش کوتاه، استفاده از نرم افزارهای خاصی به منظور کنترل کیفیت و تطابق خوانش ها با ژنوم مرجع یا ترنسکریپتوم، نقشه بردای و آنالیزهای پایین دستی است.

هدف این آزمایش بررسی و شناسایی RNAهای غیررمزکننده بلند (lncRNAs) مرتبط با عضله اسکلتی مرغ بومی اصفهان و جوجه تجاری راس 708 بود. پس از استخراج RNA از چهار نمونه عضله سینه در سن 28 روزگی، توالی یابی جفتی با استفاده از پلاتفرم illumine Hiseq 2000 انجام شد. برای هم ترازی خوانش ها با ژنوم مرجع مرغ اهلی، از نرم افزار Hisat2 و جهت سرهم بندی رونوشت ها از بسته نرم افزاری Stringtie استفاده شد. در مجموع 1097 lncRNA شناسایی شد که از این تعداد 925 ژن و رونوشت بین ژنی (اینترژنی) و 172 ژن و رونوشت اینترونی بودند. همچنین تعداد LncRNAهای جدید شناسایی شده در دو گروه بین ژنی و اینترونی به ترتیب 432 و 128 بود. آنالیز بیان افتراقی ژن منجر به شناسایی 19 ژن و 20 رونوشت با تفاوت بیان معنا دار بین دو گروه شد. بررسی جایگاه های ژنی lncRNAهای با تفاوت معنا دار، نشان داد که این ژن ها در مجاورت 45 ژن رمزکننده پروتئینی قرار دارند. از این تعداد بیان پنج ژن رمزکننده پروتئینی (ژن SCD در جوجه تجاری و ژن های GALNT15، KLHDC4، USP7 و ASB1 در مرغ بومی)-که روند بیان آنها همسو با بیان lncRNAهای همجوارشان بود-بین دو نژاد تفاوت معنا دار داشتند. بررسی عملکردی این ژن ها نشان داد که همگی در رشد عضله اسکلتی موثر هستند. نتایج حاصل از این پژوهش نشان داد lncRNAهای شناسایی شده، احتمالا پتانسیل تنظیم ژن های درگیر در رشد عضله اسکلتی را داشته و می توانند بخشی از تفاوت در سرعت رشد مشاهده شده بین دو نژاد مرغ مورد بررسی را توجیه نمایند.

گیاهان برخلاف جانوران، سلول های دفاعی متحرک نداشته و سیستم دفاعی آنها به طور طبیعی قابلیت توسعه و سازگاری در برابر بیمارگرها را ندارد. سیستم ایمنی ذاتی گیاهان بسیار پیچیده و در دو لایه مهم سازمان یافته و به سیستم پیام رسانی گسترده وابسته است. هر لایه از این سیستم از اجزاء متعددی تشکیل شده که هر یک در زمان مناسب وارد عمل می شوند. سدهای دفاعی شیمیایی و فیزیکی که از ورود بیمارگر و بروز آلودگی جلوگیری می کنند، انفجار اکسیژنی، بیان پروتئین های مرتبط با بیماریزایی و مرگ سلولی برنامه ریزی شده، همه بخش هایی از این سیستم پیچیده هستند. یکی از بهترین راه های مطالعه پاسخ های دفاعی گیاه به بیمارگر مطالعه الگوی تغییرات بیان ژن در گیاه بیمار نسبت به گیاه سالم در سطح ترانسکریپتوم است. با توالی یابی مولکول های mRNA در سلول و شناسایی ژن های مربوط به این مولکول ها می توان به الگوی تغییرات بیان ژن ها و میزان این تغییرات پس از بروز بیماری پی برد. فناوری پربرونداد (High-Through put Technologies) RNA-seq با بهره گیری از توانمندی های توالی یابی نسل دوم، امکان شناسایی و کمی سازی صدها ژن را در ترانسکریپتوم فراهم می کند. این فناوری امروزه به عنوان یکی از بهترین ابزارهای مطالعه ترانسکریپتوم برهمکنشی میزبان-بیمارگر و شناسایی ژن های درگیر در پاسخ های دفاعی گیاهان شناخته می شود.

زیره سبز (Cuminum cyminum L. ) گیاهی گلدار از خانواده چتریان (Apiaceae) است که بومی مناطق شرق مدیترانه تا هند می باشد. به رغم اهمیت دارویی فراوان زیره سبز، اطلاعات بسیار اندکی از ژنوم و مکانیسم های بیوشیمیایی ترکیبات موجود در این گیاه وجود دارد. در مطالعه حاضر جهت ارزیابی توالی رونوشت زیره سبز، از اندام گل (به دلیل تجمع بالای ترکیبات آلدئیدی و محل اصلی بیوسنتز آن)، جهت استخراج RNA از چهار نمونه و انجام آنالیز های RNA-seq استفاده شد. در نهایت، بیش از 153 میلیون خوانش به طول 50 باز از توالی یابی این نمونه ها حاصل شد. سرهم بندی خوانش ها به منظور ایجاد رونوشت های بیان شده توسط نرم افزار Trinity (نسخه 3. 1. 1) و با مقادیر kmer 25 و 32 انجام شد. بهترین سرهم بندی بر اساس کامل بودن توالی رونوشت ها با استفاده از نرم افزار BUSCO (نسخه 3) شناسایی شد. بعد از سرهم بندی خوانش ها 50973 توالی ژن (کانتیگ) با میانگین طول 725 باز و مقدار N50 برابر با 1136 باز به دست آمد. همچنین از این تعداد ژن، 53103 رونوشت شناسایی شد. از این تعداد، 35860 رونوشت دارای حداقل یک همولوگ در بانک اطلاعاتی Nr بودند. بیش از 7/66 درصد رونوشت ها حداقل دارای یک همولوگ در بانک اطلاعاتی GO (فرآیند های بیولوژیک، عملکرد های مولکولی و اجزاء سلولی) بودند. بیشتر ژن های شناسایی شده مرتبط با تنظیم رونویسی و فعالیت های غشایی بودند. در مطالعه حاضر نخستین پروفایل توالی رونوشت در گیاه زیره گزارش شد که می تواند در مطالعات بعدی به منظور شناسایی ژن های دخیل در مسیر بیوسنتزی ترکیبات ثانویه مختلف و دیگر مطالعات ژنتیکی در این گیاه مورد استفاده قرار گیرد.

مقدمه و هدف: با توجه به کاربرد روزافزون تعیین توالی نسل جدید (NGS)، جهت شناسایی ژن های عملکردی،‏ استفاده از الگوریتم ها و نرم افزارهای تخصصی برای انجام آنالیزهای آماری ضروری است. مکان یابی خوانش ها با ژنوم مرجع اولین و مهم ترین مرحله اکثر برنامه های آنالیز داده های RNA-seq است که به صورت مؤثری صحت آنالیزهای پایین دستی بستگی به این مرحله دارد. لذا هدف از این تحقیق، مقایسه برخی نرم افزارهای مختلف هم ترازی داده های حاصل از تعیین توالی کل RNA روی ژنوم مرجع بود. مواد و روش ها: از داده های RNA-seq مربوط به 54 رأس گاو شیری هلشتاین به منظور شناسایی ژن های مؤثر در باروری استفاده شد. تعیین کیفیت خوانش ها‏ توسط نرم افزار FastQC و ویرایش توالی های کم کیفیت با استفاده از نرم افزار Trimmomatic انجام شد. داده های ویرایش شده با آخرین نسخه ژنوم مرجع گاو با استفاده از نرم افزارهای Bowtie2، ‏Tophat2 و Hisat2 مکان یابی شدند. درصد کل خوانش های مکان یابی شده، درصد خوانش های مکان یابی شده روی یک محل در ژنوم مرجع و همچنین درصد خوانش های مکان یابی شده روی بیش از یک محل محاسبه شدند. یافته ها: نتایج نشان داد که بیشترین هم ترازی صورت گرفته روی ژنوم مرجع گاو با استفاده از نرم افزار ‏‏Tophat2 بوده است. از کل خوانش های موجود، نرم افزارهای Tophat2 و Hisat2 به ترتیب 94/197 و 92/526 درصد را روی ژنوم مرجع مکان یابی نمودند. نرم افزار Hisat2 عملکرد تخصیصی بیشتری داشت و 89/202 درصد از داده ها را به یک جایگاه اختصاصی مکان یابی کرد درصورتی که این پارامتر در خصوص نرم افزار Tophat2 به میزان 87/812 درصد از کل توالی ها بود. از کل توالی های به کار گرفته شده تنها 3/324 درصد توسط Hisat2 و 6/385 درصد توسط Tophat2 با بیش از یک جایگاه ژنوم مرجع مکان یابی شدند. نرم افزار Bowtie2 در مقایسه با دو نرم افزار دیگر عملکرد پایینی داشت. نتیجه گیری: مقایسه نرم افزارهای هم ترازی داده های RNA-seq روی ژنوم مرجع نشان داد که اگر چه نرم افزار Hisat2 بهترین نرم افزار برای مکان یابی خوانش ها بود بود ولی نرم افزار Tophat2 هم می تواند به جای آن در آنالیز داده های RNA-seq استفاده شود. در ضمن نرم افزار Bowtie2 در ارتباط با داده های RNA-seq کارآیی چندانی ندارد.